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    申博_BE-91菌株木聚糖酶活力测定条件的优化

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      摘要:采用单因素试验法和正交试验法对BE―91茵株木聚糖酶活力测定条件进行系统研究,获得优化的木聚糖酶活力测定条件为:按1/9的比值添加稀释100倍的木聚糖酶与预热至62℃的浓度为O,8%的木聚糖底物(用pH值5.4~5.6的0.1 mol/L柠檬酸一柠檬酸的缓冲溶液配制),62℃水浴准确反应3 min。加入2.0mL DNS溶液,沸水浴显色10min,测定波长为540 min。在此优化条件下,测得BE-91菌株木聚糖酶活力达350.24 U/mL。
    中国论文网 http://www.cqcang.com/8/view-8871980.htm
      关键词:正交试验法:木聚糖酶活力:优化;测定条件
      中图分类号:Q939.97 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(20lO)04-0950-04
      
      随着人口的增长和资源的消耗,可再生资源的开发与利用成为国内外学术界共同关注的焦点。木聚糖是半纤维素的主要组成成分,广泛分布于高等植物的细胞壁中,是自然界中一种巨大的可再生生物资源。
      木聚糖酶是一类能特异降解木聚糖的酶类,在造纸、食品、饲料、生物转化等行业有广泛的应用。酶活力是衡量酶生物活性的重要指标,在实际测定中,酶活力的结果常与所采用的各项测定条件有关,采用不同的测定条件,会得出不同的结果。当前对于木聚糖酶活力的检测方法很多。但都没有统一的标准(包括使用最为普及的DNS法)。常因应用面的不同。所采用的测定条件有所不同,导致对酶活力的最终测定结果很难进行比较。
      本研究采用单因素试验法和正交试验法对BE-91菌株木聚糖酶活力测定的条件进行探讨,以期用较少的试验次数,获得BE-91菌株木聚糖酶活力检测的最佳条件,提高了试验的效率、科学性和测定结果的准确性,为BE-91菌株分泌的木聚糖酶的相关研究提供技术基础,期望能推进木聚糖酶制剂及其相关产业的发展。
      
      1 材料与方法
      
      1.1材料
      1.1.1 菌株及木聚糖酶产酶菌BE-91菌株,中国农业科学院麻类研究所选育并保存:木聚糖酶为在适宜条件下培养的产酶菌发酵液过0.2μzm微滤膜的滤过液。
      1.1.2试剂 木糖、木聚糖购于美国Sigma公司;柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、丙三醇等均为国产分析纯。
      1.1.3仪器在位消毒自动控制发酵罐(瑞士比欧生物公司),超滤装置(德国赛多利斯公司),冷冻离心机(美国Sigma公司),便携式酸度计(意大利哈纳公司),电子分析天平(瑞士梅特勒一托利多公司),超纯水器(艾柯),移液器(美国Thermo),分光光度计、生化培养箱、磁力加热搅拌器(上海分析仪器总厂),快速恒温数显水箱(天津泰斯特),全温振荡器(江苏金坛市恒丰仪器制造有限公司)等。
      
      1.2方法
      1.2.1 D(+)一木糖母液(10 tzmol/mL)的配制 准确称取0.1500g木糖溶解于0.1m01/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液中,定容至100mL,室温保存。
      1.2.2 0.8%的木聚糖底物的配制 准确称取0.8000g木聚糖,加入80mL预热至60%的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液,磁力加热搅拌直至溶解,室温放置过夜,用0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液定容至100mL,现配现用。
      
      
      
      1.2.3 DNS溶液的配制 准确称取20.00g3,5-二硝基水杨酸溶解于1.5L去离子水中,加入32.0gNaOH并溶解,逐渐加入10g苯酚,10g亚硫酸钠,600g酒石酸钾钠,加热使上述试剂完全溶解,冷却后用去离子水定容至2000mL,室温存放在棕色瓶中。两周后使用。
      1.2.4 木糖标准曲线的绘制取6支15mm×180mm具塞试管,按表1数据分别准确移取木糖母液、0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液和DNS溶液,摇匀。沸水浴显色5min,冰水浴迅速冷却,加7mL缓冲溶液。摇匀。用分光光度计在540nm处测定标准溶液的OD值,以ODm为横坐标,木糖浓度为纵坐标,绘制木糖标准曲线C=kxA+B(式中G为木糖浓度,k为斜率,A为吸光值,B为截距),并计算该标准曲线的相关系数。
      1.2.5酶活力测定基本方法取0.1mL稀释50倍的木聚糖酶,加0.9mL预热至60%的浓度为0.8%的木聚糖底物.60℃水浴准确反应5min.同时另一管装0.1mL稀释50倍的木聚糖酶100%灭活处理,冷却后加0.9mL底物,作为对照。反应完成后分别向各管加入2.0mLDNS溶液,后续工作同标准曲线操作方法,测定OD540,根据标准曲线计算得出木聚糖酶活力。每分钟分解产生1 ta,moL木糖所需木聚糖酶的量定义为一个酶活力单位(U)?!?.2.6单因素试验设计方案 设计的因素包括测定 波长、酶液稀释倍数、酶与底物反应时间、沸水浴显色时间等。
      1.2.7正交试验设计方案在前期试验的基础上,采用L16(45)正交试验设计法。其中,木聚糖酶稀释100倍、木聚糖底物浓度0.80/0、柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液0.1 mol/L、酶与底物的体积比1:9、DNS量2.0 mL、沸水浴显色时间10 min、分光光度计测定波长540 nm为定量,选定缓冲液oH值、酶促反应温度、酶与底物反应时间为3个因素,每个因素取4个水平,Lm(4s)正交表如表2所示,不考察各因素间的交互作用。
      
      2 结果与分析
      
      2.1 单因素试验
      2.1.1 波长对木糖测定的影响及标准曲线的制作按标准曲线制作方法,分别在不同波长下测定各木糖母液的OD值,结果如表3。比较表3数据可知,紫外光对木糖的最大吸收波长为540 mm,以DD540值为横坐标,对应的木糖浓度为纵坐标?;嬷票曜记呷缤?所示?;毓榉匠涛獃=6.057 6x-0.0129相关系数R2=0.999 8。
      2.1.2酶液稀释倍数对BE-91细株木聚糖酶活力测定的影响按不同倍数稀释酶液,其他条件同1.2.5,测定各稀释倍数下BE-91菌株的木聚糖酶活力,结果如表4所示。由表4可知,稀释倍数的改变?;崦飨愿谋涿富盍Σ舛ń峁?。在一定范围内稀释倍数越大,酶活力越大,稀释倍数越小。酶活力越低;当稀释倍数适当时,测定结果才能准确反馈酶活力大小。由酶活力随酶液稀释倍数变化趋势来看,BE-91菌株分泌的木聚糖酶测定时的适宜稀释倍数为100倍。
      2.1.3反应时间的影响木聚糖酶稀释100倍,反应时间分别为5、10、15、20、25、30 min,其他条件同1.2.5,测定不同反应时间下BE-91菌株的木聚糖酶活力,结果如图2所示。由图2可以看出,反应时间在5-10 min和20-30 min之间BE-91菌株的相对酶活力变化不大,但反应时间为30min时所测木聚 糖酶活力比反应时间为5 min时所测木聚糖酶活力要低约72%。这可能是因为随着反应进行,底物浓度降低,产物浓度增加,从而加速了逆反应的进行。由此可知,BE-91菌株分泌的木聚糖酶的反应时间越短,相对酶活力越高。
      2.1.4显色时间的影响木聚糖酶稀释100倍,酶与底物反应5 min,显色时间分别为2、5、10、15、20min,其他条件同1.2.5,测定不同显色时间下BE-91菌株的木聚糖酶活力。结果如图5(注:显色时间2、10、15、20 min对应标准曲线分别为y=7.327x-.0.019 4、y=4.857x+1.384 3、y=5.525 4x+0.987 4、y=5.863x+0.874 3)。
      由图3可以看出,显色时间对测定结果有较大影响,显色时间越长,酶活力测定值越大:显色时间在10-20min时,酶活力测定值无明显差异,但显色时间为10min时所测酶活力值比显色时间为2min和5 min时所测酶活力值分别高约12.64%、7.01%。由此可以推断,BE-91菌株分泌的木聚糖酶活力测定过程中,显色时间以10 min为宜。
      
      2.2正交试验分析
      在单因素试验基础上,选定缓冲液pH值、反应温度、酶与底物反应时间3个因素,按1.2.7设计方案分别测定各个组合条件下木聚糖酶活力,结果见表5。比较表5均值k,选出优化水平组合为A2,B2,C2,即pH值5.4,温度62℃,反应时间3 min;但是,pH值5.4时的酶活力与pH值5.6时的酶活力基本持平,因此,BE-91菌株分泌的木聚糖酶作用pH值范围为5.4-5.6之间。由极差R值可以看出,3种因素影响木聚糖酶活力的主次顺序为C、B、A。做各因素与木聚糖酶活力关系图,结果如图4所示。由图4可以看出,因素C即反应时间的影响很大,在设定的4个水平上。当反应时间为5 min时,所测得的酶活力明显高于另外3个水平:因素B和因素C的影响相对缓和。在前3个水平下,酶活力总体呈上升趋势,到第四个水平时,酶活力才明显下降。
      
      2.3 方差分析
      用DPS数据处理软件对表5中数据进行方差分析,结果见表6。由表6可以看出,C因素(酶与底物作用时间)的F值(14.48)大于‰.(3,6)(9.78),为显著因素(**);A因素(缓冲液pH值)和B因素(反应温度)的F值均小于‰(3,6)(4.76),在试验选取的水平范围内不显著,证明BE-91菌株分泌的木聚糖酶的作用DH值和作用温度有较广的适应范围。作用pH值在5.4-5.6之间,反应温度在62℃左右为宜。
      
      2.4优化前后酶活力比较
      按照1.2.5酶活力测定条件和优化后酶活力测定条件,分别测定BE-91菌株培养6、8和10 h时分泌的木聚糖酶活力(重复3次),结果如表7所示。由表7可以看出,BE-91菌株培养6、8和10 h的发酵液酶活,在采用不同酶活力测定条件下的测定值有很大的差别??莶菅挎吒司鶥E-91菌株培养8 h的发酵液,在优化后酶活力测定条件下的测定值为350.24U/mL,比优化前的测定值提高了63.27%。3小结
      BE-91菌株分泌的木聚糖酶优化测定条件为:0.1 mL稀释100倍的木聚糖酶与预热至62℃的浓度为0.8%的木聚糖底物0.9 mL(用pH值5.4-5.6的0.1 mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液配制).62℃水浴准确反应3 min,加入2.0 mL DNS溶液,摇匀,沸水浴显色10 min,冰水浴迅速冷却,用蒸馏水定容至10 mL,测定540 nm波长处光吸收值,根据木糖标准曲线y=4.857x+1.384 3。计算木聚糖酶活力。在此测定条件下木聚糖酶活力达到350.24 U/mL,比优化前的测定值提高了63.27%。
      BE-91菌株分泌的木聚糖酶作用温度高,作用pH值范围广,这预示着该木聚糖酶制剂在食品加工、饲料添加剂和纸浆造纸工业等方面,将具有非常广阔的应用前景。

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